Nature | 可编程RNA引导的下一代基因组编辑系统

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基因组重排是生物基因组中的常见现象，包括插入、缺失和倒置等突变，对遗传多样性至关重要。这些重排通常由参与DNA修复过程（如同源重组）或病毒和移动遗传元件转位的酶协调。研究者们可以利用这些遗传机制开发具有独特性质的基因编辑工具。

2024年6月26日，Arc研究所的PatrickHsu团队在Nature发表了题为“Bridge RNAs direct programmable recombination of target and donor DNA”的研究论文，报道了一个最小且自主的移动遗传元件家族IS110，其能够表达一种结构化的非编码RNA，并且能够与其编码的重组酶特异性结合。该RNA通过两个内部的环状结构，与靶标DNA和供体DNA（即IS110元件本身）碱基配对，从而实现具有桥接的功能特性（Bridge RNAs）。研究证明了Bridge RNAs上与靶标结合和供体结合的环可以独立地重新编程，使得两个DNA分子之间的序列特异性重组成为可能。IS110桥接重组系统极大地丰富了基因编辑系统的多样性，不仅拓宽了原有以CRISPR和RNA干扰为基础的核酸引导体系，还为基因组设计中所需的三种基本DNA重排（插入、切除和倒置）提供了统一的机制。

背景

生物进化过程中出现了大量能够催化重新排列和多样化基因组的酶，这促使了新基因的出现和功能特化，同时为生物免疫力的提升以及病毒和移动遗传元件（MGEs）传播提供了基础。IS110元件作为一种剪切和粘贴的MGEs，它们能够无痕地从基因组中切除自身并产生环状形式，并且是唯一在其重组酶中使用DEDD催化基序的家族。IS110重组酶的N端DEDD结构域与RuvC Holliday连接分离酶具有同源性，展示出独特的作用机制。

IS621重组酶与ncRNA结合事件的鉴定

IS110元件核心中存在编码重组酶的序列（CDS），其长度约为300-460个氨基酸（图1a）；核心中CDS两侧的序列被定义为左（LE）和右（RE）非编码端，在环化切除后，该元件在重组酶CDS上游远处的连接RE-LE的核心序列上重建启动子（图1b），进而ncRNA可以从该区域表达。与其他IS家族相比，IS110的非编码端长度的中位数最大（图1d），推测具有潜在的保守功能。研究者重点研究了IS110家族成员IS621，对含有编码预测的环状RE-LE连接序列的质粒的大肠杆菌进行小RNA测序（small-RNA-seq）揭示了一个从预测的内源性σ70样启动子开始，直至跨越LE的长约177bp连续的峰（图1e）。接下来，研究者使用微量热泳动（MST）验证了体外转录的177核苷酸长度的ncRNA（来自IS621）与IS621编码的重组酶具有较高的亲和力（图1f）。

图1. IS110 家族序列特征

通过ncRNA与DNA的协变关系推断ncRNA的潜在作用

通过评估103个不同直系同源物ncRNA共识的保守二级结构，研究者发现5′茎环后面存在着两个带有明显内部环的茎环结构（图1g）。为探索ncRNA是否参与到重组酶转座识别靶标 (Target) 和供体 (Donor) DNA的过程中，研究者系统地重建了数千个IS110的插入位点和环状形式（图2a）。在对2,201个Donor-ncRNA和5,511个Target-ncRNA的序列配对进行了共变分析后，研究者确定了可能与靶标或供体DNA的上链或下链结合的ncRNA片段，发现ncRNA的两个内部环与Target和Donor DNA序列之间存在的碱基配对关系（图2b）。将这种协变模式推广到IS621序列和ncRNA二级结构上，研究者推断第一个内部环可能与Target DNA碱基配对，而第二个内部环可能与Donor DNA碱基配对，并且这种机制在不同的IS110直系同源物中具有保守性。

图2. 鉴定ncRNA与靶向和供体位点的序列特征关系

确定IS621-ncRNA的生物学功能——桥连

先前研究IS110活性的尝试仅在IS110宿主生物中取得成功，而研究者将体外转录的ncRNA与纯化的IS621重组酶以及含有靶标和供体DNA序列的dsDNA底物孵育后，检测到了预计的重组产物（图2c-e），因此推断ncRNA可能是重构重组实验所需的缺失成分。

由于该RNA在连接靶标和供体DNA分子进行重组方面具有双特异性作用起到了类似于桥梁的作用，因此被命名为bridge RNA。Bridge RNA的两个内部环称为靶标结合环和供体结合环（图2g）。靶标结合环包含两个关键区域，分别与靶标DNA的上链和下链碱基配对：左靶标向导（LTG）与靶标DNA下链左侧（左靶标；LT）碱基配对，而右靶标向导（RTG）与靶标DNA右上链（右靶标；RT）碱基配对。供体结合环具有类似的结构，其中左供体向导（LDG）与左供体（LD）的下链碱基配对，右供体向导（RDG）与右供体（RD）的上链碱基配对（图2h）。

图2. Bridge-RNA结构与功能特征

可编程靶标位点选择

Bridge RNA识别靶标和供体的碱基配对机制表明了潜在的可编程性。研究者在大肠杆菌中建立了一个双质粒重组报告系统：pTarget编码IS621重组酶、50bp靶位点和启动子，pDonor编码包含RE–LE供体序列的Bridge RNA和无启动子的GFP。pDonor与pTarget重组会将GFP置于启动子的下游，使用流式细胞术可检测到成功的重组事件（图3a-b）。

图3. 筛选方法的构建

为了全面评估bridge RNA的错配耐受性和重编程规则，研究者设计了一个大肠杆菌筛选方法，将数千对条形码标记的DNA靶标和bridge RNA连接到单个质粒上，在筛选压力下只有与WT供体质粒成功重组的细胞可以存活（图4a）。通过这种方法，研究者首先证实bridge RNA与CT靶标核心序列的两条链之间的碱基配对具有强烈的偏好性，这与靶标和供体中CT核心序列的高度保守性一致（图4b）。接下来，研究者改变了靶标的9个非核心位置以及LTG和RTG的相应位置，以评估每个位置的单错配和双错配耐受性，结果展示出所有位置都具有高度的重编程灵活性（图4b-d）。

图4. 鉴定靶标位点的可编程性

编程bridge RNA的供体特异性

在IS621元素中，供体序列比基因组靶序列更保守，这表明供体结合环可能比靶标结合环更不容易重编程。为了评估这一点，研究者设计了一个供体特异性筛选方法，其中研究者改变了核心二核苷酸两侧的7bp LD和2bp RD，所有这些都在全长RE-LE的背景下进行，以顺式表达bridge RNA（图5a）对数千个供体和供体结合环对的分析表明，供体序列可以完全重编程（图5b）。与靶标和桥RNA的靶标结合环之间的相互作用类似，LD–LDG错配和RD–RDG错配通常耐受性较差（图5c）。LD的7号位置是个例外，它表现出对胞嘧啶的强烈偏好，因此似乎比其他位置更耐受错配（图5d，e）。

图5. 鉴定供体位点的可编程性

供稿 | 张睿涵

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 雨萱

微信号：FRCBS-THU

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原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07552-4

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